РНЦХ им. Б.В. Петровского, Морфология и физиология микроорганизмов

1.    Устройство микробиологической лаборатории “чистая” и “заразная” зоны. Оборудование обеспечивающее биологическую безопасность. Основное правило движения ПБА (патогенные биологические агенты.

Устройство микробиологической лаборатории:

Входные двери: в лабораторию должно быть два входа: один для работников, другой для передачи объектов (образцов) на проверку. На входной двери должен быть обозначен знак «Биологическая опасность».

«Заразная» зона: предназначена для проведения манипуляций с потенциально опасным материалом и для всех видов работ с микробами. В этой части лаборатории на всём инвентаре, включая аппараты, стеллажи и рабочие столы, обязаны стоять знаки «Биологическая опасность». К «заразной» зоне относят помещения, где принимается и регистрируется материал, проводятся бактериологические анализы и иммунологические исследования, ПЦР-пробы. Также это комнаты, где выполняются исследования с паразитами или люминесцентная микроскопия. К «заразной» зоне относятся боксы и предбоксы, автоклавные и термостатные комнаты.

«Чистая» зона: это часть помещения, где выполняются виды работ, при которых исключено контактирование с патогенными микроорганизмами. К объектам «чистой» зоны относятся туалеты, все подсобки, гардеробные, кабинеты руководителя, комнаты для приёма пищи и отдыха, хранения документации. Также «чистой» зоной является помещение, где выполняется стерилизация, мойка посуды, готовятся, хранятся и разливаются среды для дальнейших посевов микроорганизмов.

Между «чистой» и «заразной» зоной: необходимо предусмотреть небольшой санитарный участок. Любые объекты, посуду, инвентарь или технику из лабораторий можно выносить только после выполнения обеззараживания предметов и одобрения руководителя лаборатории.

 

Оборудование, обеспечивающее биологическую безопасность:

Чистые зоны с ламинарным потоком: для их создания большое значение имеет формирование более высокого давления воздуха по сравнению с окружающими помещениями. Поступающего воздуха должно быть на 20–30% больше, нежели того, что отводится. Воздушные потоки должны перемещаться однонаправленно, строго ламинарно, без малейших завихрений.

Вытяжные шкафы: предназначены для удаления загрязнённого воздуха из рабочего пространства, а вместе с ним и запахов, газообразных соединений. Для обеззараживания вытяжных шкафов используется обработка бактерицидными облучателями.

 

Основное правило движения ПБА: движение «заразного» и «чистого» материалов должно быть разделено во времени.

 

2.    Классификация ПБА. Приведите примеры бактерий для каждой группы.

В России, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, патогенные микроорганизмы также разделяют на четыре группы:

I — возбудители особо опасных инфекций (чумы, оспы, желтой лихорадки);

II — возбудители высококонтагиозных эпидемических заболеваний человека (сибирской язвы, бруцеллеза, сыпного тифа);

III — возбудители инфекционных болезней (брюшного тифа, шигеллезов), выделяемые в самостоятельные нозологические группы;

IV — условно-патогенные микроорганизмы, возбудители оппортунистических инфекций

 

В соответствии с разделением микроорганизмов на группы по степени биологической опасности лаборатории также подразделяют на категории. По номенклатуре ВОЗ выделяют три категории микробиологических лабораторий:

базовые (основные или общего типа) лаборатории, которые в связи с конкретными особенностями работы могут быть оборудованы различными защитными устройствами;

режимные (изолированные) лаборатории;

лаборатории особого режима (максимально изолированные).

 

3. Физические и химические методы стерилизации. Автоклавирование, принцип метода и основные режимы.

Стерилизация (от лат. sterilis — бесплодный) — полное освобождение объектов от микроорганизмов и их спор. Существуют физические, химические и механические способы стерилизации. В лабораторной практике обычно применяют физические способы стерилизации

 

Стерилизация паром под давлением в автоклавах. Этот метод стерилизации основан на воздействии на стерилизуемые объекты насыщенного водяного пара при давлении выше атмосферного, при этом повышается температура кипения воды, а следовательно, и пара. Автоклав — герметически закрывающаяся стерилизационная камера, в которую помещают стерилизуемые объекты. В эту камеру поступает водяной пар из другой камеры, в которой кипит вода. Для определения давления, создающегося в стерилизационной камере, служит манометр.

Стерилизацию в автоклаве проводят в следующих режимах:

0,5 атм — 110 °С;

1,0 атм — 120 °С; (полимеры, резина, латекс)

1,5 атм — 127 °С;

2,0 атм — 132 °С. (термостойкие материалы)

Время воздействия — 15–30 мин. В автоклавах стерилизуют лабораторную посуду, питательные среды (не теряющие своих свойств при высокой температуре), операционное белье и перевязочный материал, инъекционные растворы, некоторые виды медицинского инструментария.

Дробная стерилизация текучим паром. Этот способ применяют в тех случаях, когда стерилизуемый объект изменяется при температуре выше 110 °С. Нагревание до температуры 100 °С проводят 3 раза с интервалом 24 ч, в течение которого споры, не погибающие при температуре 100 °С, переходят в вегетативные формы, которые уничтожаются при последующей обработке паром. Дробную стерилизацию при нагревании до температуры 60 °С в течение 5–6 дней называют тиндализацией.

Стерилизация горячим воздухом (сухожаровая стерилизация). В сухожаровых шкафах (печи Пастера) при температуре 160–180 °С стерилизуют лабораторную посуду, металлический инструментарий, другие термостойкие вещества.

Стерилизация ионизирующим излучением. γ-Лучами и энергией ускоренных электронов стерилизуют объекты, разрушающиеся под действием высоких температур, — изделия из полимерных материалов (одноразовые шприцы, катетеры, системы для внутривенных вливаний), некоторые лекарственные средства (ЛС).

Стерилизация прокаливанием. На огне спиртовки при температуре до 400 °С стерилизуют бактериологические петли, иглы.

Химическую стерилизацию проводят с помощью токсичных газов — окиси этилена, формальдегида, глутарового альдегида. Эти вещества разрушают нуклеиновые кислоты и ферментные системы микроорганизмов и приводят их к гибели. Данный вид стерилизации применяют для обработки изделий из термолабильных материалов. Недостаток этого метода стерилизации заключается в том, что частицы токсических химических веществ остаются на обрабатываемых объектах.

Фильтрацию (механический способ стерилизации) применяют для обработки жидкостей, совершенно не выдерживающих нагревания (питательные среды, ЛС), а также для очистки бактериальных токсинов, бактериофагов от бактерий. Для этого используют мембранные фильтры, диаметр пор которых меньше размера бактериальных клеток. Лучевая, химическая стерилизация и фильтрование — методы холодной стерилизации.

4.    Питательные среды. Основные компоненты общеростовых (общих) питательных сред. Основные источники биогенных элементов для бактерий в питательных средах.

 

Питательные среды — это специальные субстраты, которые содержат питательные вещества и используются для выращивания и культивирования микроорганизмов (бактерий, грибов) и культур клеток в лабораторных и производственных условиях.

 

 

Основные компоненты:

Вода (все процессы жизнедеятельности микроорганизмов протекают в воде)

Агар (полисахарид, определяет плотность среды)

Источник питательных веществ, энергии и микроэлементов (для гетероорганотрофных – органический источник углерода и энрегии (углеводы, аминокислоты, органические кислоты, липиды), для биосинтетических – источники азота (из пептона), серы, фосфаата, микроэлементы).

В основной (универсальной) среде – вода, питательный бульон, мясопептонный агар. На основе этой среды готовят сложные.

 

5. Классификация питательных сред применению. Приведите примеры.

По плотности: жидкие, полужидкие, плотные
По происхождению: естественные, искусственные, синтетические

По составу и цели:

А) сложные. Мясо-пептонный агар. Пептон, мясной экстракт, хлорид натрия и дополнительный компонент, например, кровь. Для Сальмонелл.

Б) элективные [для выращивания определенных микроорганизмов. Пример: холерный вибрион, щелочной агар с pH = 9],

В) дифференциально-диагностические [изучение ферментативной активности бактерий]. Среда Эндо. Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью. Колонии лактозопозитивных микробов (кишечная палочка) имеют красный цвет вследствие восстановления фуксина. Колонии лактозонегативных микроорганизмов — сальмонелл, шигелл и др. -бесцветны.

Г) комбинированные [элективная среда + дифференциальная]. Среда Цейсслера. Состав: МПА, 1% глюкоза, 20% дефибринированной крови. Используется для получения изолированных колоний анаэробных микроорганизмов, а также для изучения гемолитической активности бактерий.

(+ простая (универсальная))

 

6. Какие биологические принципы лежат в основе выбора метода посева? Почему для выделения чистой культуры используется посев плотные питательные среды, а не в жидкие?
7. В чем заключается принцип глубинного культивирования микроорганизмов? Какие преимущества этот метод дает в промышленной микробиологии и биотехнологии по сравнению с поверхностным ростом? При глубинном культивировании какие параметры контролируются?
8. Почему большинство патогенных бактерий являются строгими гетеротрофами? Как их метаболизм адаптирован к условиям организма хозяина, и какие компоненты питательных сред могут имитировать эти условия?
9. Принцип работы селективных и дифференциально-диагностических питательных сред. Приведите примеры дифференциально-диагностических сред и их принцип действия.
10. Почему ауксотрофия может быть как признаком патогенности, так и ослабленности штамма? Как используются ауксотрофные вакцинные штаммы (например, в живых вакцинах)?
11. Какие факторы могут повлиять на качество посева (толщина штриха, влажность среды, температура инкубации)? Какие ошибки чаще всего допускают?
12. Как метод посева в столбик агара помогает определить потребность бактерий в кислороде? Опишите зоны роста характерные для аэробов, анаэробов и факультативных анаэробов.

На плотную питательную среду (агар) делают укол бактериальной петлей по центру пробирки от поверхности до почти самого дна. При последующем孵обации кислород диффундирует в среду сверху вниз, создавая градиент концентрации кислорода:

Верхние слои агара (у поверхности) — богаты кислородом (высокое парциальное давление O₂).

Нижние слои агара (у дна пробирки) — бедны кислородом (низкое парциальное давление O₂, условия, близкие к анаэробным).

Таким образом, одна пробирка создает для бактерий весь спектр условий — от аэробных до анаэробных. Бактерии будут расти только в тех зонах, где концентрация кислорода соответствует их метаболическим возможностям.

. Облигатные (строгие) аэробы

У поверхности. Рост наблюдается только в верхней части столбика, в виде плотной полосы или «шапочки».

 

2. Облигатные (строгие) анаэробы

У дна. Рост наблюдается в нижней части столбика, вдали от поверхности.

 

3. Факультативные анаэробы

По всему столбику, но с наибольшей интенсивностью у поверхности. У поверхности, где много кислорода, их рост самый густой, так как аэробное дыхание дает больше энергии. По мере углубления рост становится менее интенсивным, но все же заметным.

 

4. Аэротолерантные анаэробы

Равномерно по всему столбику. Рост равномерный от верха до низа, без выраженного усиления у поверхности, так как они не получают преимущества от наличия кислорода.

 

5. Микроаэрофилы

В виде узкой полосы в средней части столбика. Именно там концентрация кислорода для них оптимальна — ниже, чем на поверхности, но выше, чем на дне.

 

 

13. Структурная организация клеточной стенки прокариотических клеток: химический состав, функциональное значение и связь с тинкториальными свойствами бактерий.

 

14. Каково биологическое значение подвижности бактерий? Какие структуры отвечают за подвижность, и как их можно различить микроскопически (в живых и фиксированных препаратах)?
15. Объясните физико-химические механизмы каждого этапа окраски по Граму. Почему грамотрицательные бактерии теряют комплекс кристаллический фиолетовый–йод при обработке спиртом, а грамположительные — нет?

А) На фиксированный мазок кладут сухую полоску фильтровальной бумаги, пропитанной карболово-спиртовым раствором генцианового фиолетового (по Синеву), наносят на нее 2–3 капли воды и выдерживают 1–2 мин.

Б) Бумагу снимают пинцетом и, не промывая водой, наносят на мазок раствор Люголя на 1 мин; мазок при этом чернеет.

В) Сливают раствор йода, обесцвечивают 95% этиловым спиртом, наливая его 2–3 раза или погружая стекло в стаканчик со спиртом в течение 30–40 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

Г) Тщательно промывают мазок водой для удаления спирта.

Наносят на мазок водный раствор фуксина на 1–2 мин.

Сливают краску, промывают мазок водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Д Грамположительные бактерии окрашиваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет в начале окраски, грамотрицательные — контрастным красителем в красный цвет на последнем этапе окрашивания

В основе дифференциации бактерий лежит строение клеточной стенки грамположительных (толстостенных) и грамотрицательных (тонкостенных) бактерий, вследствие чего они неодинаково воспринимают красители при окраске по методу Грама.

Причина: наличие многослойного пептидогликана, наличием тейхоевых и липотейхоевых кислот (которые отсутствуют у грамотрицательных бактерий) и особенностями структурной организации клеточной стенки, поры в которой сужаются при обработке спиртом, задерживая краску. В связи с тем что грамотрицательные бактерии имеют один слой пептидогликана и большое количество липидов в составе их клеточной стенки, она имеет более высокую проницаемость и при обесцвечивании спиртом комплекс «генциановый фиолетовый–йод» легко удаляется через поры клеточной стенки, в результате чего грамотрицательные бактерии приобретают цвет контрастного (дополнительного) красителя — водного фуксина.

Подавляющее большинство бактерий хорошо окрашиваются по методу Грама, поэтому его считают основным в микробиологии. Исключение составляют спирохеты, плохо воспринимающие анилиновые красители, внутриклеточные паразиты (риккетсии и хламидии), а также бактерии, не имеющие клеточной стенки (микоплазмы и L-формы бактерий). Микобактерии в связи с особенностями строения их клеточной стенки обычно окрашивают по методу Циля–Нильсена.

16. Какие ошибки при окраске по Граму могут привести к ложной интерпретации Грам-принадлежности? Приведите примеры артефактов, связанных с недостаточной или чрезмерной деколоризацией, и объясните, как их избежать.

 

Недостаточная деколоризация происходит, когда спирт-деколоризатор действует слишком короткое время или его концентрация недостаточна. В результате первичный комплекс «кристаллический фиолетовый — йод» не вымывается из грамотрицательных бактерий.

Результат: Ложноположительный результат (False Gram-positive). Грамотрицательные бактерии (которые должны быть розовыми/красными) остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет и интерпретируются как грамположительные.

Решение: производить деколоризацию строго определенное время (15-30 секунд), использовать контрольные штаммы, промывать тщательно

Избыточная деколоризация — происходит, когда спирт воздействует слишком долго. Он разрушает липидный слой грамположительных бактерий и вымывает комплекс «кристаллический фиолетовый — йод» из них.

Результат: Ложноотрицательный результат (False Gram-negative). Грамположительные бактерии (которые должны быть сине-фиолетовыми) теряют цвет и при докрашивании фуксином становятся розовыми/красными, интерпретируясь как грамотрицательные.

Дополнительние ошибки:

Использование старых культур (хуже удерживают комплекс)

Смывание комплекса водой

Слишком толстый мазок культуры

 

17. Почему фиксация мазка пламенем является важным этапом подготовки препарата? Как чрезмерный или недостаточный прогрев влияет на последующую окраску и морфологию клеток?

• Закрепление материала на предметном стекле, предотвращая его смывание при окрашивании
• Умеренную коагуляцию белков, что улучшает восприятие красителей
• Дезинфекцию препарата, делая его безопасным для дальнейшего исследования
• Сохранение морфологии клеток в естественном состоянии

При чрезмерном прогреве происходят следующие негативные изменения:

• Клетки могут деформироваться или разрушиться
• Происходит перегрев и изменение структуры клеточных элементов
• Красители хуже связываются с тканями
• Возможно появление артефактов при микроскопии

При недостаточном прогреве:

• Препарат может быть смыт во время окрашивания
• Клетки сохраняют способность к передвижению, что искажает их расположение
• Эффективность окрашивания снижается из-за слабой фиксации
• Возможно загрязнение препарата при последующих манипуляция

18. Устройство и принцип работы светового микроскопа. Характеристика основных компонентов: механическая система, оптическая система (объективы, окуляры, конденсор) и осветительный блок. Влияние параметров оптики на качество изображения.

Лучи света от источника проходят через тонкий срез объекта исследования, закреплённого на предметном столике, и попадают на систему линз объектива и окуляра, увеличивающих изображение. Общее увеличение микроскопа — это произведение увеличений объектива и окуляра.

 

Световой микроскоп предназначен для изучения объектов размером не менее 0,2–0,3 мкм (это его предельная разрешающая способность).

Он состоит из механической и оптической частей (рис. 2.14).

Механическая часть микроскопа состоит из штатива, включающего основание и тубусодержатель, тубуса с револьвером для крепления объективов, предметного столика для закрепления препарата. В нижней части штатива-тубусодержателя находятся макро- и микровинты для грубой и тонкой настройки изображения путем перемещения столика или тубуса с объективами (в зависимости от модели).

Оптическая часть микроскопа включает набор объективов на револьверной насадке, окуляров, конденсор с ирисовой диафрагмой, в некоторых моделях — двустороннее зеркало для направления лучей света непосредственно в линзу объектива. Большинство современных световых микроскопов оснащено встроенным осветителем и не комплектуется зеркалом.
Конденсор микроскопа — это элемент осветительной системы прибора, который собирает, фокусирует и направляет световой поток на исследуемый объект.

Применяют монокулярный (имеет один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы. Конденсор микроскопа предназначен для фокусировки света от осветительного прибора на исследуемом препарате. Апертурная диафрагма необходима для правильного освещения препарата.

Общее увеличение микроскопа ориентировочно определяют произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Таким образом, в световом микроскопе при использовании иммерсионного объектива ×90 или ×100 и окуляра ×15 возможно получить 1350–1500-кратное увеличение. Однако качество изображения определяется не максимальным увеличением, а разрешающей способностью микроскопа, то есть возможностью различать отдельно две близко расположенные точки.

 

19. Физические основы иммерсионной микроскопии. Роль иммерсионной среды в повышении числовой апертуры объектива и разрешающей способности микроскопа.

Между покровным стеклом и фронтальной линзой объектива вводится прозрачная жидкость — иммерсия (кедровое масло, глицерин и др). Эта жидкость имеет показатель преломления (n), близкий к показателю преломления стекла (n ≈ 1.5). (При этом на микроскопе ставится максимум по окуляру и объективу, пространство между ними и стеклом минимальное).

Физический смысл: Иммерсионная среда устраняет границу раздела «стекло-воздух», заменяя ее на границу «стекло-жидкость-стекло». Поскольку показатели преломления этих сред близки, резко уменьшается явление преломления и отражения света.

Световые лучи, идущие под большими углами, теперь без значительного преломления попадают в объектив.

Увеличивается угловая апертура объектива — он собирает больше света от объекта.

Повышается не только яркость изображения, но и, что самое главное, разрешающая способность (раздельное изображение двух близких друг к другу точек).

 

20. Принцип фазово-контрастной микроскопии: физические основы преобразования фазовых сдвигов в амплитудные контрасты. Области применения в биологических исследованиях. Конструктивные особенности и назначение инвертированных микроскопов.

Задача фазово-контрастной микроскопии: Преобразовать невидимые глазу фазовые различия в видимые различия амплитуды (интенсивности), т.е. сделать объект контрастным на светлом или темном фоне.

1. Формирование двух компонентов света:

• Прямой (недифрагированный) свет (S): Это свет, который проходит через препарат, не взаимодействуя с объектом. Он формирует яркий фон изображения.
• Дифрагированный свет (D): Это свет, который отклоняется (дифрагирует) на структурах объекта. Именно он несет информацию об объекте.

2. Наложение фазового сдвига:

• Дифрагированные лучи (D) отстают по фазе от прямых лучей (S) на небольшую величину (обычно ~λ/4) из-за того, что проходят через более плотную среду объекта.
• При интерференции в плоскости изображения эти лучи с почти одинаковой амплитудой, но с небольшой разностью фаз, не дают существенного контраста. Происходит лишь небольшое перераспределение интенсивности, неразличимое для глаза.

3. Преобразование фазового сдвига в амплитудный контраст (гениальное решение Фрица Цернике):
   Для этого в микроскопе установлены два специальных элемента:

• Кольцевая диафрагма (Aperture Stop): Располагается в передней фокальной плоскости конденсора. Она создает освещение в виде полого конуса света (кольца). Это разделяет прямой свет (проходящий кольцом) и дифрагированный свет (рассеивающийся во все стороны).
• Фазовая пластинка (Phase Plate): Располагается в задней фокальной плоскости объектива. Она имеет вытравленное фазовое кольцо, которое точно совпадает с изображением кольцевой диафрагмы.

Фазовая пластинка выполняет две ключевые функции:

1. Дополнительный фазовый сдвиг: Она дополнительно сдвигает фазу прямого света (S) еще на λ/4. Теперь общая разность фаз между прямым и дифрагированным светом составляет уже не λ/4, а λ/2 (или 0, в зависимости от типа контраста). Это соответствует условию минимума или максимума интерференции.
2. Ослабление амплитуды: Фазовая пластинка часто покрыта слоем металла, который ослабляет амплитуду прямого света (S).

Результат интерференции:
Теперь в плоскости изображения интерферируют:

• Прямой свет (S) — ослабленный по амплитуде и сдвинутый по фазе.
• Дифрагированный свет (D) — неослабленный и не сдвинутый фазовой пластинкой.

Вследствие этого интерференция становится конструктивной (усиление, объект светлее фона) или деструктивной (ослабление, объект темнее фона). Невидимые фазовые variations превращаются в четкие видимые контрасты яркости.

Назначение: исследование неспособных к окрашиванию, живых, подвижных клеток, процессов жизнедеятельности, органелл.

Инвертированные микроскопы нужны для исследования объектов, которые невозможно разместить под стандартной моделью. Это связано с конструкцией прибора: оптическая система расположена под объектом исследования, а не над ним

 

21. Электронная микроскопия: физические принципы формирования изображения с использованием электронных пучков. Сравнительный анализ разрешающей способности световой и электронной микроскопии. Основные типы электронных микроскопов и их применение.

 

Основная идея: Заменить поток фотонов (свет) на поток электронов. Так как длина волны электрона на порядки меньше длины волны видимого света, это позволяет сильно увеличить разрешающую способность.

отличие от фотонов, электроны сильно взаимодействуют с веществом, что является основой для формирования контраста.

Поскольку электроны являются заряженными частицами, на них можно воздействовать магнитными (и электростатическими) полями. Для этого используются магнитные линзы — катушки с током, создающие неоднородное магнитное поле, которое фокусирует пучок электронов аналогично тому, как стеклянная линза фокусирует свет.

Процесс формирования изображения:

1. Источник (электронная пушка): создает поток электронов (например, за счет термоэмиссии или полевой эмиссии).
2. Ускорение: электроны ускоряются в вакууме высоким напряжением (десятки-сотни кВ).
3. Фокусировка: система магнитных линз (конденсор) формирует тонкий пучок.
4. Взаимодействие с образцом: пучок проходит через ультратонкий образец (для ПЭМ) или сканирует его поверхность (для РЭМ).
5. Формирование изображения: Прошедшие (ПЭМ) или вторичные/отраженные электроны (РЭМ) регистрируются детектором. Интенсивность сигнала в каждой точке зависит от локальных свойств образца (плотность, толщина, атомный номер, рельеф), что и создает контрастное изображение.

По сравнению со световой микроскопией:
1) увеличение 1000000х (у световой максимум 1500х), среда – вакуум (а не воздух или иммерсия), линзы не стеклянные а мгнитные.

1. Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ / TEM)

Принцип действия: Тонкий пучок электронов проходит через ультратонкий образец (толщиной 50-200 нм). Изображение формируется из электронов, прошедших сквозь образец.

Контраст возникает за счет:

• Амплитудный контраст: Более плотные или толстые участки образца сильнее рассеивают электроны и выглядят темнее.
• Фазовый контраст: Интерференция электронных волн, прошедших через образец, позволяет достигать атомного разрешения (высокоразрешающая ПЭМ, HRTEM).

Применение ПЭМ:

• Исследование внутренней ультраструктуры клеток: мембран, органелл, рибосом, цитоскелета.
• Вирология: изучение структуры вирусов.
• Нанотехнологии и материаловедение: анализ кристаллической структуры, дефектов в материалах, наночастиц.
• Крио-ПЭМ: быстрое замораживание образца позволяет изучать белки и молекулярные комплексы в близком к нативному состоянии.

2. Сканирующий электронный микроскоп (РЭМ / SEM)

Принцип действия: Сфокусированный электронный зонд (пучок) сканирует поверхность образца построчно. Детекторы регистрируют вторичные электроны, отраженные электроны или рентгеновское излучение, возникающее при взаимодействии зонда с образцом. Сигнал преобразуется в изображение, где яркость каждой точки соответствует интенсивности сигнала с этой точки.

Контраст возникает за счет:

• Топография: Вторичные электроны лучше emitted с неровностей и выступов, создавая псевдо-трехмерное изображение рельефа.
• Состав: Отраженные электроны чувствительны к атомному номеру элемента (Z-контраст): области с более тяжелыми элементами выглядят ярче.

Применение РЭМ:

• Изучение поверхности клеток, тканей, микроорганизмов, пыльцы.
• Материаловедение: анализ изломов, пористости, морфологии порошков и покрытий.
• Полупроводниковая промышленность: контроль качества микросхем.
• Крио-РЭМ: изучение поверхности замороженных гидратированных биологических образцов.

 

 

22. Флуоресцентная микроскопия: принципы детекции флуоресценции, используемые флуорохромы и фильтры. Преимущества метода по сравнению с традиционной световой микроскопией. Основные области применения в клеточной и молекулярной биологии.

Основной принцип: Метод основан на способности специальных молекул — флуорохромов — поглощать свет определенной длины волны (высокой энергии) и через крайне короткий промежуток времени испускать свет другой, более длинной волны (низкой энергии). Этот процесс называется флуоресценцией.

1. Возбуждение (Excitation): Флуорохром в образце облучают светом с короткой длиной волны (высокой энергией), например, синим или зеленым светом.
2. Поглощение (Absorption): Электроны флуорохрома переходят из основного состояния в возбужденное.
3. Безызлучательная релаксация (Vibrational Relaxation): Часть энергии теряется в виде тепла.
4. Эмиссия (Emission): Электроны возвращаются в основное состояние, испуская квант света с большей длиной волны (меньшей энергией), например, зеленый или красный свет.
5. Детекция (Detection): Этот испущенный свет (эмиссия) регистрируется детектором (камерой или фотоумножителем). Свет возбуждения при этом не должен попадать в детектор.

Флуорохромы: синентические или органические красители или белки, внедряемые генной инженерией

Чтобы разделить свет возбуждения и эмиссии, используется комбинация из трех оптических элементов:

1. Фильтр возбуждения (Excitation Filter):
   • Расположение: Между источником света и образцом.
   • Назначение: Пропускает только тот узкий диапазон длин волн, который необходим для возбуждения конкретного флуорохрома. Остальной свет блокируется.
2. Дихроичное зеркало (Dichroic Mirror) или делитель пучка (Beamsplitter):
   • Расположение: Под углом 45° после фильтра возбуждения.
   • Назначение: Это интерференционное зеркало, которое отражает свет определенных длин волн (свет возбуждения) в сторону образца и пропускает свет других длин волн (свет эмиссии) в сторону детектора.
3. Фильтр эмиссии (Emission Filter или Barrier Filter):
   • Расположение: Перед детектором.
   • Назначение: Окончательно «очищает» сигнал, пропуская только свет флуоресценции и блокируя любые остаточные лучи возбуждения, которые могли рассеяться в образце.

Вся эта комбинация (ФВ + ДЗ + ФЭ) называется фильтровым кубом.

 

 

23. + Что такое общее микробное число и количество жизнеспособных клеток? В каких единицах измеряют общее микробное число и количество жизнеспособных клеток? В чём заключается разница между этими показателями, и почему важно оценивать оба параметра при анализе микробной обсемененности объектов?
24. Камера Горяева и ее применение в мик робиологии для подсчета микроорганизмов?
25. Почему метод серийных разведений считается «золотым стандартом» для определения жизнеспособных клеток? Какие факторы могут исказить результат (например, агрегация клеток, выбор среды, температура инкубации)?
26. Основной принцип определения количества бактериальных клеток по оптической плотностью (ОП)? Почему зависимость между ОП и числом клеток носит приближенный характер и требует калибровки для каждого вида?
27. В каких случаях применяется метод мембранной фильтрации? Почему он особенно важен при санитарно-гигиеническом контроле воды и воздуха, и какие требования предъявляются к фильтрам?
28. Понятия вид, клон, штамм, изолят, чистая культура.

А) Вид (species) — основная единица биологической систематики живых существ, совокупность особей, объединенных по близким свойствам, но отличающихся от других представителей рода.
Эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющих единый генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими и другими признаками. Микроорганизмы получают свои видовые названия в соответствии с международными правилами бинарной (биноминальной) номенклатуры

Б) Клон — культура микроорганизма (популяция клеток), полученная из одной   клетки путём бесполого размножения.

В) Чистую культуру микроорганизмов, выделенных из определенного источника и отличающихся от других представителей вида, называют штаммом

Г) Совокупность однородных микроорганизмов, выросших на питательной среде, которые обладают сходными морфологическими, тинкториальными (отношение к красителям), культуральными, биохимическими и антигенными свойствами, называют чистой культурой.

Д) Изолят — это вариант патогенного или непатогенного организма, выделенный из какого-то конкретного источника и идентифицированный до уровня вида. Может отличаться от характерного для вида штамма по тем или иным свойствам.

29. Основные компоненты эукариотической клетки.
30. Основные и особенные характеристики строения ядра простейших.

У простейших может быть одно ядро  (Trypanosoma и Leishmania) или два ядра (лямблии и инфузории) либо имеется стадия многоядерности (Plasmodium, Toxoplasma и Eimeria)

• У инфузорий микронуклеус ведет себя как нормальное ядро (митоз, мейоз, участие в коньюгации), но генетический материал не транскрибируется. Зато макронуклеус делится амитотически, после коньюгации исчезает, состоит из сотен копий фрагментов хромосом, зато транскрипционно активен

31. Дополнительные компоненты клетки простейших.

Пелликула у простейших — это уплотненный наружный слой цитоплазмы, который выполняет защитную функцию и придает клетке постоянную форму. У разных групп простейших пелликула имеет разное строение: у эвгленовых и некоторых других она может быть эластичной и содержать микротрубочки, а у Alveolata она состоит из альвеол (плоских мембранных пузырьков). Пелликула может иметь различные выросты и скульптуры на своей поверхности.

Жгутики являются производными от белка флагеллина (у бактерий и архей) или микротрубочек (у эукариот, таких как простейшие и сперматозоиды), а также других белковых структур, составляющих клетку

32. Основные компоненты клетки бактерий.
33. Дополнительные компоненты клетки бактерий.
34. Строение клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных бактерий.

У грамотрицательных – две мембраны и между ними тонкий

слой пептидогликана.
Периплазма – это компартмент грамотрицательных бактерий,

расположенный между цитоплазматической (внутренней) и

внешней мембраной

Периплазма — раствор множества белков и гликанов, более вязкий чем цитоплазма

Функционально играет роль изолированной прихожей, контролирующей вход и выход веществ из цитоплазмы

Внутри периплазмы расположен слой пептидогликана

Внутрення мембрана состоит из фосфлипидов

Внешняя мембрана ассиметрична: внутренний слой состоит из фосфолипидов, внешний слой — из гликолипидов

(липополисахаридов –ЛПС – триггера врожденного иммунного ответа). Имеет порины – белки матрикса самой мембраны, образуя гидрофильные поры.
Компоненты ЛПС:

Липид А (две молекулы глюкозамина, связанные со многими жирными кислотами), заякоривает к внутренней мембране

Центральный олигосахарид – связывает липид А и О-антиген

О-антиген – определяет серологические свойства бактерии (используется для классификации)

У грамположительных – одна мембрана и внешний толстый

слой пептидогликана (связывает ковалентно с клеточной стенкой), липотейхоевыми кислотами (связывает гидрофобно с мембраной), прошитого белками и тейхоевыми кислотами.

Пептидогликан состоит из повторяющихся единиц дисахарида N-ацетилглюкозамин-N-ацетилмурамовая кислота, которые

сшиты боковыми цепями пентапептида

 

35. Особенности строение клеточной стенки микобактерий и микоплазм.

 

Микобактерии (Mycobacterium) — род аэробных грамположительных медленнорастущих кислотоустойчивых палочкообразных бактерий. Приставку «Мико-« получили за псособность образовывать структуры, похожие на грибной мицелий.

В клеточной стенке Mycobacterium tuberculosis 60-90% липидов (в ср. у бактерий 2-8%) Липиды микобактерий: миколовые кислоты, воскД, корд-фактор – трегалоза-6,6-димиколат. Метод окраски микобактерий – метод Циля- Нильсена только микобактерии окрашиваются в красный цвет.
Клеточная стенка микобактерий является самой сложной.

Пептидогликаны (муреин) служат каркасом клеточной стенки и отвечают за осмотическую защиту клетки.

Арабиногалактаны образуют полисахаридную основу стенки и связывают пептидогликановый слой и миколовые кислоты.  Липоарабиноманнан пронизывает стенку бактерии и выходит на ее поверхность, обусловливая антигенные свойства бактерии.

С внешней стороны клеточная стенка окружена слоем длинноцепочечных миколовых кислот. Гены их метаболизма занимают более 20% генома туберкулезной микобактерии. Сверху вся клетка покрыта полисахаридным капсуло-подобным материалом, на котором закреплено большинство антигенов и который обеспечивает взаимодействие с другими бактериями и клетками человека.

Микоплазмы – класс бактерий, не имеющих клеточную стенку.

Микоплазмы отличаются от остальных бактерий отсутствием жёсткой клеточной стенки (в результате чего от внешней среды их отделяет лишь цитоплазматическая мембрана) и ярко выраженным полиморфизмом.

36. Основные морфологические формы бактериальной клетки.

Кокки — шаровидные бактерии размером 0,5-1,0 мкм; по взаимному расположению клеток различают микрококки, диплококки, стрептококки, тетракокки, сарцины и стафилококки. Микрококки (от греч. micros — малый) — отдельно расположенные клетки или в виде пакетов кокк

 

Палочки – бациллы (эшрихе колли, сибирская язва), диплобациллы (Moraxella bovis, конъюктивит), стрептобациллы (Streptobacillus spp)
+ коккобациллы (Bordetella pertussis, коклюш) и паллисады (Bacillus subtilis, сенная палочка)

Спиралевидные (извитые):

А) Вибрион (холерный вибрион)

Б) Спирилла (хиликобактер пилари). Пучок жгутиков на конце клетки

В) спирохета (бледная трипонема). Отличаются от спирилл подвижностью и изгибательными движениями. Имеют жгутики.

 

L-формы бактерий – бактерии, частично или полностью лишенные клеточной стенки под действием антибиотиков.

Helicobacter pylori (H. pylori) – активно делящаяся спиралевидная бактерия, которая в стрессовых условиях принимает кокковидную форму

37. Автотрофы, гетеротрофы, фототрофы, хемотрофы, прототрофы, ауксотрофы, сапрофиты, паразиты.

аутотрофы (от греч. autos — сам, trophe — питание), которые используют для построения своих клеток неорганический углерод в виде СО2

гетеротрофы (от греч. heteros — другой), которые используют органический углерод.

Фототрофы — организмы, для которых источником энергии является свет

Хемотрофы — организмы, которые получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций. Среди хемотрофов выделяют литотрофы (от греч. lithos — камень), способные использовать неорганические доноры электронов (Н2, NH3, H2S, Fe2+ и др.), и органотрофы, которые используют в качестве доноров электронов органические соединения.

Ауксотрофы (от греч. аuхо — выращиваю, увеличиваю и trophe — питание), бактерии, грибы или водоросли, утратившие в результате мутации способность синтезировать из более простых веществ-предшественников одно из веществ, необходимых для их роста.

Сапрофиты (от греч. sapros — гнилой, phy-ton — растение), которые питаются мертвым органическим материалом и независимы от других организмов

паразиты (от греч. parasites — нахлебник) — гетеротрофные микроорганизмы, зависимые в получении питательных веществ от макроорганизма.

Облигатные паразиты полностью лишены возможности жить вне клеток макроорганизма. К ним относятся представители родов Rickettsia, Coxi-ella, Ehrlichia, Chlamydia и других, размножающиеся только внутри клеток макроорганизма. Факультативные паразиты могут жить и без хозяина и размножаться, как и сапрофиты, на питательных средах in vitro, то есть вне организма.=

38. Аэробное дыхание.
39. Анаэробное дыхание и брожение.
40. Механизмы пассивного транспорта.

Пассивный транспорт использует кинетическую энергию   энтропию молекул, движущихся по градиенту концентрации

• Существуют 2 вида пассивного

транспорта – пассивная диффузия и облегченная диффузия

Облегченная диффузия происходит по градиенту концентрации переносимых веществ

Позволяет попадать в клетку заряженным и полярным молекулам, которые не пропускает гидрофобный внутренний слой мембраны.

Осуществляется трансмембранными каналами и транспортными белками (пермеазами)

Пассивная диффузия – по электрохимическому градиенту. Пассивно через мембрану проходят низкомолекулярные незаряженные неполярные молекулы, совсем маленькие полярные молекулы, гидрофобные молекулы, O2; H2O2; СО2; N2; Н2О. Скорость пассивной диффузии зависит от размера и полярности молекулы и от градиента концентраци

41. Механизмы активного транспорта.

Активный транспорт – это процесс перемещения веществ (ионов, молекул) через клеточные мембраны против их градиента концентрации с затратой энергии. Осуществялется только специализированными белками.

АТФ-заивисмый – с использованием энергии АТФ. Пример: АБЦ-транспортер (см. соответствущий вопрос)

Градиент-зависимый — основан на одновременном перемещении двух молекул – одной по градиенту концентрации, другой – против. Энергия берется из электрохимического градиента ионов снаружи и внутри мембраны.

• Различают два типа Градиент-зависимого активного транспорта– симпорт и антипорт

Вторичный активный транспорт основан на использовании низкой концентрации ионов натрия внутри клеток, создаваемой мембранным ферментом Na+,K+-АТФазой. Специфический белок-транспортер связывает на апикальной поверхности энтероцитов аминокислоту и ион натрия. Важно то, чтов отсутствие натрия аминокислота не в состоянии  связаться с белком-переносчиком.

Затем, изменив свое положение в мембране, белок отдает ион натрия в цитозоль по градиенту концентрации. Сразу после этого аминокислота теряет связь с белком и остается в цитоплазме.

 

Зависящий от других источников – градиенты давления, энергия света, ОВРи др

42. Трансмембранные каналы и транспортные белки (пермеазы).

Порины – трансмембранные белки грамотрицательных бактерий, импортирующие вещества в периплазму. Диаметр канала и заряд формирующих его аминокислот

определяют селективность порина.

Через порины в периплазму попадают заряженные, гидрофильные и слишком крупные для пассивной диффузии молекулы, включая ионы, аминокислоты и и

сахара с размерами, не превышающими 500 Да.

• Через порины в периплазму попадают некоторые

антибиотики, включая тетрациклины и бета-лактамы.

• У грамположительных бактерий поринов нет за

исключением Mycobacteria

Пермеазы – трансмембранные ферментоподобные белки, осуществляющие

направленный перенос веществ через мембрану. Пермеазы, присоединившись к субстрату, повышают его способность проникать через мембрану.

Есть и у грамм-положительных, и грамм-отрицательных бактерий
Осуществляют как активный, так и пассивный транспорт
Селективный

меняют конфигурацию после связывания транспортируемого вещества, что приводит к освобождению захваченного

снаружи вещества внутри клетки, так же могут менять конфигурацию самого переносимого вещества

43. АБЦ-транспортеры.

ABC-транспортеры – суперсемейство мембранных каналов, осуществляющих активный транспорт различных веществ за счет гидролиза АТФ. ABC-экспортеры, осуществляющие транспорт из клетки во внешнюю среду, встречаются повсеместно у всех ныне живущих клеточных форм жизни: от бактерий до человека[1]. ABC-импортеры, закачивающие вещества из внешней среды в клетку, характерны только для прокарио

АВС-транспортеры состоят из трансмембранного транспортного белка (пермеазы) и АТФ-связывающий кассеты и для взаимодействия с субстратом обычно требуют субстрат-связывающий белок переносчик (локализуется в периплазматическом прострнстве). Обеспечивает высокую специфичность белка и гидролиз АТФ внутри самого транспортера.

• АВС– транспортеры, участвуют в импорте соединений в цитоплазму клетки,называются АВС-импортеры
• АВС-импортеры, импортирующие олигопептиды, называются

олигопептидными пермеазами (белки, транспортирующие метаболиты внутрь клетки) (oligopeptide permeases (Opp).

44. Фосфоенолпируват-зависимая фосфотрансферазная система.

Механизм дыхания, присущий только прокариотам. Активируется, когда в клетке недостаточно глюкозы для тривиальных путей метаболизма

ФТС одновременно переносит сахар через клеточную мембрану и фосфорилирует его, используя фосфатную группу фосфоенолпирувата.

Реакции гидролиза обратимы, поэтому в условиях недостатка глюкозы в клетке бактерии начинается процесс глюкогенеза и накапливается фосфоенолпируват (ФЕП), который запускает

активность ФТС ФТС состоит из 2х цитоплазматических

компонентов, белков энзима I (ЕI) и HPr, — и одного трансмембранного – белка энзим II (ЕII).

ФТС состоит из 2х цитоплазматических компонентов, белков энзима I (ЕI) и HPr, — и одного трансмембранного – белка энзим II (ЕII).

• EII – транспортный белок, уникальный для

каждого сахара

• EI и HPr – одинаковые для всех сахаров

EI превращает ФЕП в пируват и фосфат, перенося фосфат на

себя, а затем фосфорилирует HPr

• HPr фосфорилирует EII
• EII фосфорилирует сахар и импортирует фосфорилированный сахар в клетку

Сахар попадает в полость фосфорилированного EII, которая

стерически соответствует именно этому сахару.

• Перенос фосфата с EII на сахар меняет конформацию EII, что открывает выход для сахара в цитоплазму
• EII – это пермеаза, активность которой регулируется фосфорилированием

45. Эффлюксные насосы.

Эффлекс насосы – системы активного транспорта, обеспечивающие секрецию веществ из микроорганизма.
Эффлюксные насосы выводят из цитоплазмы небольшие экзогенные молекулы, большинство из которых представляют собой антибактериальные, токсичные для бактерий соединения.

Простейший класс эффлюксных насосов — АВС

(АБЦ)- транспортеры, использующие энергию АТФ (АВС-экспортеры)

АВС-экспортеры состоят из трансмембранного домена (пермеазы) и АТФ-связывающей кассеты.

Эффлюкс-системы, способные экспортировать несколько субстратов, включая несколько разных классов антибиотиков, могут быть причиной множественной антибиотикоустойчивости бактерий.

46-47. Sec и TAT

Sec — General Secretion Pathway

• ТАТ-Twin arginine translocation
• Пути Sec и Tat являются наиболее высококонсервативными

механизмами секреции белков и были выявлены во всех доменах

жизни (бактерии, археи и эукариоты)

• У грамположительных бактерий Sec и ТАТ системы опосредуют

секрецию, т.е. доставку белка изнутри бактерии наружу

• У грамотрицательных бактерий Sec и ТАТ системы опосредуют

транслокацию белка из цитоплазмы в периплазматическое

пространство

• Хотя системы Sec и Tat имеют несколько общих элементов, они

транспортируют белки по принципиально разным механизмам:

Sec транспортирует развернутые белки, а ТАТ -свернутые.

У прокариот, в том числе и патогенных, Sec-путь обеспечивается цитоплазматическим белком SecА и тремя интегрированными в цитоплазматическую мембрану белками SecY, SecE и SecG. Белки, предназначенные для транспорта этим путем, имеют на своем N-конце сигнальную последовательность, с которой еще во время трансляции связывается белок SecА. Далее самостоятельно или с помощью белка-шаперона SecB (этот шаперон нужен некоторым белкам для предотвращения сворачивания уже готовой белковой цепи в нативную структуру) SecА-белок доставляет направляющийся на секрецию белок к тому месту внутренней мембраны, где находятся белки SecY, SecE и SecG. SecА прикрепляет секретируемый белок к белку SecY и одновременно обеспечивает процесс транслокации энергией, поскольку обладает АТФазной активностью. Транслоцируемый белок через образованную белками SecY, SecE и SecG пору перемещается в периплазматическое пространство, и специальная пептидаза отщепляет от него сигнальную последовательность, после чего освободившийся от связи с мембраной белок может принять нативную конформацию.

На первом этапе предназначенный для секреции белок связывается с комплексом TatC, который специфически узнает последовательность S/TRRXFLK в сигнальном пептиде. Это вызывает перестройку в находящемся рядом комплексе TatB, что приводит к созданию в этом месте мембраны протонного градиента. Наличие протонного градиента и связанного предназначенного для секреции белка приводит к перемещению отдельно расположенных в мембране молекул TatА-белка и их олигомеризации в кольцевую структуру. Вокруг секретируемого белка объединяется несколько десятков молекул (в среднем их количество определено как 25), и эта кольцевая структура имеет внутренний диаметр, достаточный для прохождения белка в периплазму. После этого начинается третий этап. Предположительно с участием протонного градиента белок втягивается в образовавшуюся пору, и специальная мембранная пептидаза отрезает белок от сигнальной последовательности. После того, как секретированный белок оказывается в периплазме в свободном состоянии, осуществляется этап 4 – переход ТАТ-системы в исходное состояние.

46. Система секреции III типа грамотрицательных бактерий.

СС3ТТ – это молекулярный шприц, пронизывающий цитоплазматическую мембрану клетки человека, чтобы доставить туда факторы патогенности. Характерен только для грамотрицательных патогенных бактерий.

Структурно и эволюционно СС3Т происходит от бактериальных жгутиков (флагелл).

СС3Т состоит из трех основных компонентов:

• базального тела, закрепленного во внутренней и внешней мембранах бактериальной клетки;
• полой иглы, проходящей через базальное тело за пределы клеточной стенки;
• комплекса кончика иглы, называемого транслоконом.

Базальное тело содержит АТФ-зависимый экспортный

аппарат.

Транслокон действует как регуляторная «заглушка» для

иглы, так и как порообразующий комплекс, создавая пору в мембране клетки-мишени и инициируя секрецию

из иглы.

Белок-фактор патогенности синтезируется на рибосомах и с

помощью белка-шаперона доставляется к базальному телу СС3Т

• Для проталкивания секретируемого белка в полость иглы, используется энергия АТФ
• Сигналом начала секреции является взаимодействие транслокона с мембраной клетки человека.

Энергия для передачи берется благодаря энергии АТФ, расщепляемой бактериальной цитоплазматической АТФазой